Visualización de las interacciones entre proteínas de la familia BCL-2 mediante BIFC en células vivas

La apoptosis es un proceso esencial para mantener la homeostasis tisular y fallos en su regulación dan lugar a patologías, como procesos tumorales. El tratamiento actual de muchos tumores se basa en drogas citotóxicas que inducen muerte celular por la ruta mitocondrial de la apoptosis. Las señales desencadenadas por estos agentes convergen en la mitocondria y producen la liberación de factores apoptogénicos como el citocromo c que junto a la proteína Apaf-1 forma el complejo apoptosoma [1], capaz de activar la caspasa 9 iniciadora, que a su vez activa a las caspasas ejecutoras 3 y 7 las cuales llevarán a cabo la proteolisis de distintos sustratos celulares. Otro factor apoptogénico es AIF (Factor Inductor de Apoptosis), capaz de causar la condensación de cromatina independientemente de la acción de las caspasas [2]. La fase inicial de la ruta intrínseca de la apoptosis está regulada por las proteínas de la superfamilia Bcl-2 [3]. Dentro de esta superfamilia se encuentran proteínas antiapotóticas (Bcl-2, Mcl-1, Bcl-XL), proapoptóticas multidominio (Bak, Bax) y proapoptóticas sólo-BH3 (Bim, PUMA, Noxa, Bik, Bid), que solamente comparten con el resto de miembros el dominio de homología BH3. Las interacciones entre los miembros de esta familia regulan la activación de las proteínas Bak y Bax y posterior permeabilización de las membranas mitocondriales. Sin embargo, no se ha podido caracterizar completamente el mecanismo molecular por el que ocurre esta activación ni cómo las moléculas efectoras oligomerizan para llevar a cabo la permeabilización de las membranas. Existe un modelo de activación indirecta que propone que las proteínas antiapoptóticas actúan neutralizando a Bak y Bax, y que las proteínas sólo-BH3 que se inducen por estímulos apoptóticos, cuando se unen a las antiapoptóticas liberan a las moléculas efectoras activas [4, 5]. Otro modelo totalmente opuesto defiende la capacidad de ciertas proteínas sólo-BH3, denominadas activadoras y entre las que se ha propuesto a Bim, Bid y más recientemente PUMA y Noxa, de unirse de manera directa a Bak y Bax y causar su activación, cuando son liberadas de las antiapoptóticas por unión a éstas de los miembros sólo-BH3 sensibilizadores (Bad, Bik) [6, 7]. Datos previos de nuestro laboratorio muestran que la presencia de las proteínas Bak y Bax es esencial para la sensibilidad de las células a estímulos apoptóticos [8]. El trabajo con neoplasias hematológicas ha permitido observar que la apoptosis inducida por fármacos antitumorales hace aumentar los niveles de proteínas proapoptóticas como PUMA [9] o Bim [10]. También se ha visto el aumento de expresión de Bim tras el tratamiento con glucocorticoides, que hace exceder la capacidad de bloqueo de dicha proteína por Mcl-1 [11], quedando por lo tanto moléculas de Bim libres para activar a proteínas efectoras. El objetivo principal de mi trabajo de tesis doctoral ha sido estudiar las interacciones entre las proteínas de la familia Bcl-2, mediante la técnica de Complementación de Fluorescencia o BiFC. Esta técnica se basa en la formación de complejos fluorescentes por asociación de dos fragmentos de una proteína fluorescente cuando éstos se encuentran suficientemente próximos debido a la interacción de dos proteínas a las que dichos fragmentos se encuentran fusionados [12, 13]. En la literatura existen varios trabajos sobre las interacciones entre miembros de la familia Bcl-2. Sin embargo, la mayoría de datos se han obtenido con péptidos sintéticos y en sistemas libres de células. Mediante esta técnica, hemos podido caracterizar una serie de interacciones empleando las proteínas enteras y en modelos celulares. Además, esta técnica permite estudiar interacciones débiles o transitorias, difícilmente detectadas por otras técnicas. Hemos utilizado los vectores pBiFC-VN173 (que contiene el fragmento amino de la proteína Venus) y pBiFC-VC155 (con el fragmento carboxilo de la misma proteína fluorescente). Hemos generado un primer conjunto de proteínas de fusión de manera que los cDNA correspondientes a las proteínas Bim, PUMA, Noxa, Bak y Bax se han fusionado al fragmento VN173 y las proteínas Bak, Bax, Mcl-1 y Bcl-XL se fusionaron al fragmento VC155. Además, hemos generado una serie de mutantes de delección del dominio BH3 en las proteínas Bim, PUMA, Bak y Bax, de la primera hélice alfa en Bak y Bax y un mutante de sustitución de un aminoácido del dominio BH3 de Noxa (NoxaL29E), para evaluar la implicación de estas regiones de las proteínas en las interacciones con las distintas parejas. Hemos optimizado las condiciones de transfección de células HeLa y HCT116 con Lipofectamina y hemos evaluado en todos los casos los niveles de expresión de las proteínas de fusión respecto a las endógenas. Hemos empleado un tercer vector que contiene la proteína mRFP que nos ha servido de control interno de transfección. De esta manera, hemos podido calcular por citometría de flujo el porcentaje de células que presentan complejos fluorescentes así como la intensidad media de fluorescencia de la señal de BiFC respecto de la de mRFP. También hemos analizado la localización subcelular de los complejos por microscopía confocal y en determinados casos se ha analizado la formación de los complejos a lo largo del tiempo por microscopía de ¿time-lapse¿. Los resultados se han confirmado utilizando un segundo conjunto de vectores, en los que se ha intercambiado el fragmento (VN o VC) al cual se encuentra fusionada cada proteína. Por otra parte, se ha evaluado la influencia de la posición donde se fusiona el fragmento de la proteína fluorescente en algunas proteínas. Para ello se han generado líneas estables por infección retroviral derivadas de HeLa que sobreexpresan las proteínas EYFP-Mcl-1, Mcl-1-EYFP, EYFP-Bcl-XL y Bcl-XL-EYFP y se han realizado transfecciones transitorias para las fusiones EYFP-Bax y Bax-EYFP. El análisis por microscopía confocal ha permitido ver que solamente la localización de Bcl-XL se encuentra alterada cuando tiene su extremo carboxilo bloqueado. Por ello, se generó un nuevo vector que contiene la fusión VC155-Bcl-XL. Nuestros resultados indican que las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL se unen preferentemente a las proteínas sólo-BH3 Bim, PUMA y Noxa, interacción requiere la presencia del dominio BH3 de las segundas. También se ha podido detectar interacción de los miembros antiapoptóticos con Bak y Bax aunque en menor porcentaje de células y con complejos de menor intensidad de fluorescencia y se ha visto la implicación de los dominios BH3 de las segundas en estas interacciones. Cabe destacar que además hemos podido detectar la interacción de las proteínas sólo- BH3 Bim, PUMA y Noxa tanto con Bak como con Bax, lo cual apoyaría la capacidad de éstas de activar a las segundas por unión directa, un tema muy debatido en la literatura. Es interesante mencionar que los estudios de microscopía confocal y de ¿time-lapse¿ han revelado la formación de estos complejos en células que posteriormente adquieren fenotipo apoptótico. Los complejos Bim/Bax aparecen inicialmente en el citosol y se translocan a continuación a las mitocondrias. Nuestros resultados además, confirman la importancia del dominio BH3 de las proteínas sólo-BH3 a la hora de interaccionar con las proteínas multidominio Bax y Bak, viéndose la formación de los complejos fluorescentes significativamente reducida al deleccionar o modificar esta región de la proteína. Hemos obtenido también resultados interesantes acerca de la zona en la que las proteínas Bim, PUMA y Noxa se unen a Bak y Bax. Nuestros datos indican que la primera hélice de Bax es el lugar de unión de las proteínas sólo-BH3, coincidiendo con datos publicados anteriormente [14, 15], mientras que tanto esta región como el dominio BH3 de Bak son necesarios para estas interacciones. Hemos obtenido datos sobre la dimerización de Bak que indican la importancia de su dominio BH3 en este proceso, mientras que para Bax nuestros resultados sugieren la implicación de su primera hélice alfa. Estos datos ponen de nuevo en evidencia diferencias importantes en el proceso de activación y oligomerización de estas proteínas. Además, hemos generado líneas estables por infección retroviral derivadas de HeLa que sobreexpresan las proteínas antiapoptóticas Mcl-1 y Bcl-XL. Hemos comprobado por citometría de flujo que las interacciones de las proteínas sólo-BH3 con Bak/Bax se ven reducidas tanto en porcentaje de células como en intensidad de los complejos y las imágenes de microscopía time-lapse han permitido comprobar que existe un retraso en la formación de estos complejos. Datos preliminares obtenidos mediante la técnica BiFC multicolor, han permitido observar la existencia de una competición entre proteínas antiapoptóticas y Bak/Bax por unirse a las proteínas "solo-BH3"